原代細胞的培養(yǎng)方法 蒂科生物

原代細胞培養(yǎng)成功以后，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
1. 操作步驟
（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。
（2）向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶內加入Hanks液少量，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。
（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
（6）用計數板計數后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
（7）細胞培養(yǎng)換液時間應根據細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。
2. 注意事項
（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。
（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。
三、體內細胞培養(yǎng)及其操作步驟
1． 瘤細胞懸液接種
（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或對數生長期培養(yǎng)瘤細胞。   
（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經80～100目篩網過濾成細胞懸液。
（3）培養(yǎng)細胞應用PBS洗兩遍。
（4）計數并調整細胞濃度至107～108／ml。
（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml／部位，＞106細胞)。初次接種成功率低，細胞數盡可能多一些。
（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，zui后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。
2． 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細胞，將這種腹水反復傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。
（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌，進行細胞計數。
（2）消毒動物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞。
（3）接種腹水瘤細胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。
（4）抽取的腹水經3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆谩?br />四、培養(yǎng)細胞的凍存及復蘇
細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
1． 凍存細胞
（1）選對數增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。
（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。
（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。
操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復蘇細胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。
（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
（5）用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。
凍存細胞數量要充分，密度應達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數量。

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