細菌污染的原因有哪些？

污染向來是在細胞培養(yǎng)中的大問題。預(yù)防或治理污染是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。我們在細胞培養(yǎng)時，在開始階段就要十分重視污染問題，否則會功盡棄，這樣不僅浪費時間，也會浪費人力、物力。 

    (一)  有哪幾類污染？

    在細胞培養(yǎng)過程中的污染不只是指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。  

    1、細菌污染

    細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡。  

    2、真菌污染

    真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中見的一種，的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。真菌污染后，細胞生長變慢，但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

    3、支原體污染

    支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的小微生物，小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。  培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。   

    4、非同種細胞污染

    由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目，上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。   細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

    （二）污染類型的區(qū)別

    1、細菌、真菌污染的檢測

    (1)  肉眼觀察 ---- 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。 

    (2)  接種觀察 ---- 用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。  

    (3)  鏡下觀察 ---- 倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。   

    2、支原體污染的檢測

    (1)  相差顯微鏡觀察 ---- 接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。注意與細胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。 

    (2)  熒光染色法觀察 ---- 熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。 

    (3)  電鏡檢測 ---- 條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養(yǎng)48～72小時，細胞接近匯合，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。 
    (4)  培養(yǎng)檢測 ---- 細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋"菌落出現(xiàn)。 

    （三）病毒的檢測

    (1)  應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動物病毒病 

    (2)  逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測病毒