細(xì)胞培養(yǎng)問題匯總答疑

復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。

解凍后的細(xì)胞可以直接接種到含有*培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。

如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

注：操作時戴好手套，防止凍傷；

帶上防護眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿

出來的管子液氮爆炸……

細(xì)胞培養(yǎng)時能否更換培養(yǎng)基種類？

首先得確定現(xiàn)在用的培養(yǎng)基是否適合您的細(xì)胞生長。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞增殖和形態(tài)正常的情況下最好不要更換培養(yǎng)基，細(xì)胞都有各自適應(yīng)的培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)條件，細(xì)胞可能無法快速適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

若必須更換，可嘗試半換，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

更換培養(yǎng)基的方法：

如果是貼壁生長的細(xì)胞， 一般可以直接把培養(yǎng)液吸掉， 再加入新的。加的時候注意不要對著長細(xì)胞的那一面。

如果是懸浮型的， 就需要低速離心 （把所有的細(xì)胞和培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管里， 或有些離心機配有直接離心細(xì)胞培養(yǎng)皿的裝置）， 然后再吸掉上清液。加入新的培養(yǎng)液使細(xì)胞重新懸浮。

首先要確定更換胎牛血清的理由，如果細(xì)胞培養(yǎng)無異常的話，不建議隨意更換不同品牌和來源的胎牛血清。

血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的來源（血源地）和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同地域和等級的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞死亡。

如果是使用的胎牛血清出現(xiàn)了問題，比如保存不當(dāng)或操作不當(dāng)導(dǎo)致血清成分析出、混濁、污染等情況，可以優(yōu)先更換同品牌、等級、批次的血清。

如果是產(chǎn)品質(zhì)量問題更換血清品牌的話，需要用一批細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實驗才行，以保證細(xì)胞能夠正常培養(yǎng)。

另外大家在購買胎牛血清的時候要選擇正規(guī)來源和經(jīng)過海關(guān)檢疫胎牛血清，非正規(guī)來源的胎牛血清有很多安全隱患，對實驗室、操作人員、細(xì)胞培養(yǎng)、實驗數(shù)據(jù)都有很大的影響。

一般在拿到細(xì)胞后，應(yīng)該注意什么？

收到細(xì)胞后先不要開蓋，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時后（看細(xì)胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議對收細(xì)胞時的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各一張），排除細(xì)胞本身污染的情況；收到細(xì)胞未開封，出現(xiàn)污染狀況一般可以再申請免費發(fā)送一株細(xì)胞。

收到細(xì)胞時如無異常情況，請在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時，請按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。

培養(yǎng)細(xì)胞什么時候需要換液？

視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

培養(yǎng)基到底要不要加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

如果是沒有進(jìn)行過細(xì)胞培養(yǎng)的新手，對無菌技術(shù)沒有信心的，或者提取的原代細(xì)胞，怕污染的，可以適量添加抗生素。

抗生素本身也是有毒性的，有些抗生素的藥效濃度水平與毒效濃度水平非常接近，對細(xì)胞多少有傷害。

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應(yīng)使用5CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

酚紅一般作為培養(yǎng)基中pH值的指標(biāo)：當(dāng)培養(yǎng)基呈中性時為紅色，呈酸性時為黃色，堿性時為紫色。另外，酚紅可以模擬類固醇激素（特別是雌激素）的作用。如果要避免類固醇反應(yīng)，可以在無酚紅的培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)。

二價的離子會抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg這樣的二價離子。

胰酶也要注意不要反復(fù)凍融哦！

如何避免細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染？

主要還是考慮無菌環(huán)境，盡量做好操作臺的滅菌，別把培養(yǎng)基滴落在生物安全柜的入風(fēng)口，別在培養(yǎng)箱里把培養(yǎng)基打翻。這兩個地方霉菌一旦滋生，那你就只能等著用甲醛熏蒸了。

紫外無法殺滅霉菌，酒精也不行，只能用甲醛熏蒸，但是一定要注意安全。復(fù)蘇的時候，水浴鍋也需要進(jìn)行滅菌處理。一旦出現(xiàn)污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情況下，選擇扔掉……

避免交叉感染，要不只能整個實驗室消毒了。