細胞的復蘇經驗總結！

在細胞復蘇過程中，有多次復蘇失敗，最終在查閱了相關技術積累了足夠的復蘇技能后復蘇成功，現將細胞復蘇的操作程序和注意事項總結如下，望能為實驗人提供些參考。

材料
1.常規細胞培養儀器設備、恒溫水浴振蕩器。
2.培養液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）。

操作程序
1.細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min以上。
2.培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。
3.二甲基亞砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，備用。
4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40度水浴中，快速搖晃，直至凍存液*融化。
5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。
6.用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放培養箱中培養。
7.記錄復蘇日期。

注意事項
1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是*無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內使凍存液*融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產品。
3. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。
4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇，結果無異常。
5. 細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6. 復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。
7. 加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。